Przygotowanie nasienia przed inseminacją lub in vitro

Procedura laboratoryjna przygotowania nasienia przed inseminacją lub zapłodnieniem pozaustrojowym ma na celu:

• oddzielnie plemników od plazmy nasienia
• usunięcie z powierzchni plemników substancji hamujących ich zdolność do zapłodnienia
• zapoczątkowanie mechanizmów ułatwiających plemnikom zapłodnienie komórki jajowej
• wyselekcjonowanie plemników o prawidłowej budowie i ruchu
• usunięcie z nasienia bakterii i wirusów

Obecnie najczęściej stosowane techniki przygotowania nasienia to:

• płukanie nasienia
• separacja plemników na nieciągłym gradiencie podłoża (density gradient centrifugation - DGC)
• metoda migracji wstępującej – „swim up”

Płukanie nasienia
Metoda ta jest najprostszą techniką przygotowania nasienia. Płukanie nasienia przeprowadza się poprzez dodanie 3-10 ml podłoża do nasienia (najczęściej w proporcji 3:1). Probówkę taką wiruje się z prędkością 300-400 G przez okres 5-10 min. Po zakończeniu wirowania delikatnie usuwa się supernatant zostawiając najniższą warstwę z osadem. Po wymieszaniu gotowa jest do inseminacji  domacicznej. Proste płukanie nasienia ma na celu oddzielenie plazmy nasienia, martwe plemniki i inne komórki pozostają w preparacie.

Wirowanie w gradiencie gęstości
Na dwie warstwy gradientu w stożkowej probówce nawarstwia się 1-2 ml ml nasienia. Probówkę wiruje się 20 minut z przyspieszeniem 300 G. Po odwirowaniu należy delikatnie usunąć supernatant i górną warstwę gradientu zostawiając najniższą warstwę, którą uzupełnia się świeżym medium do płukania nasienia. Preparat następnie wiruje się przez 5-10 min z przyspieszeniem 150-200 G. Po odwirowaniu delikatnie usuwa się supernatant, pozostawiając dolną warstwę z osadem. Po wymieszaniu tak przygotowane nasienie gotowe jest do inseminacji lub zapłodnienia pozaustrojowego.

Swim up
1 ml upłynnionego nasienia jest umieszczany w probówce, następnie nawarstwia się ok. 2 ml podłoża. Probówka przez 60 min. powinna być umieszczona w inkubatorze lub cieplarce w temperaturze 37 st. C. Po upływie ustalonego czasu delikatnie usuwa się supernantant, który może bezpośrednio być użyty do inseminacji lub też po dodaniu 2-3 ml medium wirowany jest z przyspieszeniem ok. 300 G przez 10 min. Po zakończeniu wirowania delikatnie usuwa się supernatant zostawiając najniższą warstwę z osadem. Po wymieszaniu nasienie gotowe jest do inseminacji domacicznej. W metodzie tej wykorzystuje się zdolność poruszania się plemników z nasienia (osadu) do podłoża. Tak przygotowane nasienie gotowe jest do inseminacji domacicznej lub zapłodnienia pozaustrojowego.

Wskazania
Badając odsetek żywych urodzeń nie udowodniono wyższości żadnej z powyższych technik. Biorąc pod uwagę ilość ruch plemników i obecność hiperaktywacji optymalną techniką przygotowania nasienia jest wirowanie na nieciągłym gradiencie.
Sprzęt niezbędny do przygotowania nasienia

• mikroskop
• szkiełka do analizy nasienia
• komora do liczenia plemników
• wirówka
• sterylne pipety Pasteura, jałowe próbówki 10-15 ml, rękawiczki, cieplarka/łaźnia wodna (37 st. C) strzykawki 1 ml